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脊髓横断模型(大鼠)——自由落体打击法

时间:2025-02-05 11:19:15点击次数:

一、实验动物选择

选用SD大鼠作为实验对象,雌雄不限,周龄为6-8周。

二、造模具体操作步骤

1. 术前准备:造模手术前2小时,对大鼠腹腔注射青霉素钠2×10⁵U,以此达到抗炎目的。

2. 麻醉、消毒与固定:完成相应准备工作。

3. 胸椎T10节段定位:用手触摸大鼠背部,先找到胸椎最高点,从该点往上数3个棘突对应的椎体位置,即为胸椎T10节段。

4. 背部切口操作:在T9-T11节段对应的背部位置,做正中直切口。随后使用止血钳,以钝性分离的方式,将开口处皮肤与肌肉层之间的黏膜分离开。

5. 暴露手术区域:借助辅助固定钩将两侧皮肤拉开,使手术区肌肉视野充分展现。用眼科剪在中线(棘突边缘)两侧的肌肉上做直切口。若出现少量出血情况,用棉签清理手术区域。接着,用眼科剪剪掉T9-T11节段区域的棘突以及其他少量多余的肌肉组织,让T9-T11节段的椎板完全暴露出来。

6. 脊髓背侧暴露:去除两侧关节突,使脊髓背侧呈现出直径约0.5cm的圆形暴露区域。需要注意的是,暴露范围必须大于选用的撞击头直径,且不能有骨突残留,避免重物自由下落时受到周围组织的遮挡。

7. 打击器位置与高度调整:把自由落体打击器的位置调整到使撞击头移动至脊髓背侧需要打击的实验位置,之后再对打击器的垂直高度进行调整。调整至撞针球面刚好贴住脊髓骨膜,然后让其自由抬高到合适位置(撞击头抬高2-3mm)。

8. 砝码放置与定位:在撞击针上方2.5cm高度处插入定位销,挑选合适的砝码(10g)放入金属打击管内。

9. 实施打击:迅速拔出定位销,让砝码以自由落体的方式撞击撞击针,从而产生25gcf的致伤能量。

10. 术后初步观察:迅速移开自由落体打击器后,仔细观察大鼠的心跳和呼吸情况,确保无异常现象。

11. 缝合与抗感染处理:按照肌肉、筋膜、皮肤的顺序依次进行缝合,缝合完成后用碘伏对切口及周围进行消毒处理。在伤口周边撒上青霉素粉剂,预防感染。

三、成模鉴定方法

1. 行为观察:撞击后若观察到大鼠躯体出现颤抖,鼠尾呈现痉挛性摆动,双下肢先迅速回缩扑动,随后瘫痪,并且肉眼可见脊髓硬膜下有血肿形成,表明造模可能成功。假手术组大鼠仅进行棘突和椎板切除术,不开展SCI造模操作。

2. BBB运动功能评分法:观察时长设定为4min,在125cm×125cm的空间范围内进行评分。采用三人盲法,在评分前对评分人员进行培训,使其深入掌握评分细则与标准。三位评分人员在同一时刻独立观察大鼠双后肢的运动功能,并做好记录与评分,最终选取三个评分中的最低值作为功能评分结果。BBB评分标准详细说明如下:0-7分,重点关注关节是否活动以及活动关节的数量;8-14分,主要看脚掌能否接触地面,着地后能否进行运动以及运动是否协调;15-18分,着重观察脚尖能否抓地,脚尖方向与前进方向是否一致,前后肢运动是否协调;19-21分,主要判断运动时躯干是否稳定,尾巴是否上翘。

BBB评分的定义:将动物放入以开口盆,轻敲盆壁,使其爬行,观察动物的臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况。BBB评分(Basso,Beattie&Bresnahanlocomotorratingscale,BBBscale)

(大鼠脊髓损伤)评分标准
0分无可见后肢运动
1分一或两个关节轻微运动,通常为髋和/或膝关节
2分一个关节大幅活动或一个关节大幅活动且有另一关节轻微活动
3分两个关节大幅活动
4分后肢全部三个关节可轻微活动
5分两个关节轻微活动,第三个关节可大幅活动
6分两个关节大幅活动,第三个关节可轻微活动
7分后肢全部三个关节可大幅活动
8分非承重情况下可以爪掌面着地
9分足底仅位于负重位,或偶尔/频繁/持续以足背负重步行,无足底负重步行。负重:足底负重位时或仅在后躯干抬高时,HL伸肌收缩
10分偶见爪掌面承重移动;无前后肢协调动作
11分可较多的见到掌面承重移动,但无前后肢协调动作
12分可较多的见到掌面承重移动,偶见前后肢协调动作
13分常见掌面承重移动,可常见前后肢协调动作
14分有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作;或出现常见的掌面移动,持续型前后肢协调动作,偶有爪背侧移动
15分持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作,前肢前进过程中无或偶有抓地;初接触时主动爪位置与身体平行
16分步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作,前肢前进过程中常见爪抓地;初接触时主动爪位置与身体平行,负重转移后旋转
17分步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作,前肢前进过程中常见爪抓地;初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行
18分步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作,前肢前进过程中可持续性爪抓地:初接触时主动爪位置均与身体平行,负重转移后旋转
19分步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作,前肢前进过程中可持续性爪抓地;初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。尾巴有时或总是下垂
20分持续性掌面移动,持续性协调步态,足趾持续抓地,初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行,躯干不稳定,尾巴持续翘起
21分持续性掌面移动,持续性协调步态,足趾持续抓地,活动过程中主动爪位置始终与身体平行,躯干持续稳定,尾巴持续翘起
注:HL(hindlimb):后肢。轻度:小于等于百分之五十的关节活动范围。大幅是指大于百分之五十的关节活动范围。2个关节通常指髋关节和膝关节。第3个关节通常为踝关节

3. Rivlin斜板试验:采用改良的Rivlin方法,使用一块预先粘贴好3mm厚橡胶垫的长方形木板作为斜板,该斜板通过与底板连接的铰链实现旋转,以此调节斜板倾斜的角度。将大鼠放置在斜板上,使其头部朝前,身体长轴线与斜板的纵轴垂直。检测从水平位置(0°)起始,每次将斜板旋转升高5°,逐步增大斜板与水平面之间的角度,记录大鼠能够停留5秒的最大角度,该角度即为其功能角度值。正常情况下,大鼠维持身体停留5秒时,斜板的倾斜角度约为73°。

4. HE染色:仔细且完整地取出伤段及头尾段共1.0cm的脊髓组织,将其放入预先装有4%多聚甲醛的离心管中,固定24小时后进行HE染色,随后在光镜下观察脊髓损伤区及邻近部位的病理变化情况。

四、造模周期

整个造模周期为3天。

五、后续检测指标建议

仔细游离并完整取出伤段及头尾段共1.0cm的脊髓组织,放入预盛有4%多聚甲醛的离心管中固定24小时,HE染色后光镜观察脊髓损伤区及邻近部位的病理变化。

六、注意事项

1. 体温维持:术后大鼠体温通常较低,需将其放置在体温维持仪上,保证体温稳定。

2. 排尿护理:给大鼠进行排尿护理时,先用手指触摸找到充盈的膀胱,接着按住膀胱底部,按照自上而下的方向轻轻挤压,促使尿液排出。挤压过程要保持耐心、动作轻柔,严禁粗暴用力。若尿液挤出困难,可用温水适度刺激膀胱区及外生殖器。同时要避免对尿道区及外生殖器进行不当的机械刺激,防止出现尿道水肿及外生殖器水肿翻出的情况,并定期做好清洁工作。

3. BBB评分注意事项:进行BBB评分前,务必先将大鼠尿液排净,防止影响实验结果。评分时要认真、细致地观察大鼠四肢的行走状况,并做好记录。

4. 术后全面护理:术后将动物分笼饲养,保证自然光照和通风良好。每天更换清洁、干燥的垫料,始终保持环境干燥。密切观察动物的精神状态、饮食情况、排尿排便状况、有无肢体水肿和压伤、有无泌尿系统血性分泌物等。每日进行3次人工排尿,腹腔注射青霉素,剂量为10万U/次,每天2次。注意防止大鼠出现自残行为以及肠梗阻现象。

5. 模型调整:模型严重程度可依据实验具体要求,通过调整撞击次数、撞击高度来实现。建议在正式实验前进行预实验,以确定最合适的参数设置。



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