蛛网膜下腔出血模型

一、动物相关信息

1. 动物品种：SD 大鼠
2. 动物性别：雄性

3. 动物周龄及体重：体重处于 250 - 300g 范围

   
   

二、造模方法

1. 前期准备：先对大鼠实施麻醉、消毒处理，随后将其妥善固定。
2. 血液采集：使用经肝素预润的针筒抽取 0.2 ml 血液。
3. 手术操作
   • 将大鼠头部稳固固定在已安装微量注射泵的脑立体定位上，于头皮中线上切开一个 2cm 的矢状切口。
   • 精确在前卤 0.1mm、右侧 4 mm 处做好钻孔标记，保证孔洞位于冠状缝位置。
   • 运用钻头在标记处垂直钻孔，操作过程务必注意避免损伤硬膜。之后把 0.2 ml 未肝素化的血液装入针筒，将针的斜面放置在与中线相反方向，把针尖插入脑组织直至针尖完全消失。
   • 使针垂直插入右侧尾状核 5.5 mm 处，以 10 μl/min 的速度将 100 μl 自体全血缓慢灌入右侧基底节区。灌注结束后，针头继续留置 2 min。

   • 缓慢拔出针，用骨蜡填抹钻孔处，随后缝合皮肤。

     
     

三、成模鉴定

1. 一般情况观察：密切留意实验动物的日常表现。
2. 特定试验检测
   • 放置测试：通过该测试对大鼠相关能力进行评估。
   • 转角试验：以此试验获取大鼠行为学相关数据。
3. 生理指标检测
   • 脑水容量检测：鉴于脑水肿与脑出血患者的生存率关联紧密，需检测脑水肿的形成情况。主要采用干湿重法对脑水容量进行测定。
   • 血脑屏障通透性检测：常用的检测手段有荧光同位素法、伊文思蓝（Evans blue）染色法，此外，利用 DAB 染色法做 IgG 染色同样能够检测血脑屏障的通透性。
   • 脑基因组学分析：旨在明确基因表达的改变情况。

   • 组织学评估：全面评估出血量、出血位置、出血范围，以及神经细胞死亡状况和脑萎缩情况。

     
     

四、后续检测指标建议

1. 脑水容量：采用干湿重法检测脑水肿形成情况，因脑水肿对脑出血患者生存率影响重大。
2. 血脑屏障通透性：运用荧光同位素、伊文思蓝（Evans blue）染色、DAB 染色法做 IgG 染色等方法进行检测。
3. 脑基因组学：确定基因表达的变化情况。
4. 组织学：评估出血量、出血位置、范围、神经细胞死亡情况及脑萎缩情况。

5. 脑组织 HE 染色：对脑组织进行 HE 染色分析。

   
   

五、注意事项

1. 饲养管理：造模后的大鼠需进行单笼喂养，注重做好保温工作。若在造模过程中或造模后大鼠死亡，导致无法收集到该组实验所需数据，应按照相同随机原则选用备用大鼠进行替代。
2. 标本获取：在每组预定的时间点（1 天、3 天、5 天），待大鼠麻醉成功后，使其呈仰卧位。沿腹部中线，先用组织剪依次剪开皮肤，再钝性分离皮下组织，接着剪开腹部肌肉和腹膜，然后钝性分离下腔静脉。使用一次性静脉采血针抽取 3ml 静脉血，将血液在室温下放置 2 小时后，放入离心机中，在 2 - 8 摄氏度、1000r/min 的条件下离心 15 分钟，取上层血清分装到防冻管中，放置于 -20°C 的冰箱内保存，以备后续检测使用。
3. 脑组织取材：采血完毕后，立即用止血钳夹闭下腔静脉及腹主动脉，继续沿着腹中线向上剪至剑突位置，剪开膈肌，再沿胸骨旁开 2cm 分别剪开两侧肋骨，用组织钳提取胸骨向上固定，充分暴露心脏。将连接输液器的注射针插入左心室尖部，快速滴注生理盐水，同时用眼科剪剪开右心耳，持续进行灌注，灌注速度先快后慢，直至大鼠眼球、上爪变白，且右心耳灌注液变清亮时停止灌注。迅速断头取脑，完整剥离脑组织，放入 4%的多聚甲醛中浸泡 48 小时，用于后续病理检测。
4. 温度控制：在缺血性脑损伤以及脑出血模型中，温度的微小变化都可能产生影响。脑出血后大鼠自身的体温调节功能会受到影响，实验后期动物体温可能急剧下降，这种温度变化会干扰脑出血模型的实验结果。因此，需要采用颅骨温控和肛门温控措施，并且在术后 48h 内将动物饲养在温控保温箱中。
5. 性别因素：在缺血性卒中模型和脑出血模型中，性别对实验结果存在影响。在缺血性卒中模型里，雌性动物的行为分数以及脑梗死体积相较于雄性动物明显减少；在脑出血模型中，雌性动物在行为学上的恢复期更短，脑血肿也较小。雌性动物的神经保护作用可能与循环中的雌性激素和黄体酮有关，所以实验通常选择雄性动物。
6. 手术出血处理：手术过程中若遇到出血问题，可使用止血绵和骨蜡进行止血。
7. 注射速度考量：与以往模型的快速注射方式不同，此模型采用慢性注射法将血液注入脑部软组织。这种慢性注射方式不仅能够限制血液外渗进入蛛网膜下腔，更逼真地模拟自然过程，还能避免对毗邻组织产生生理性压力伤害。
8. 血液来源选择：脑水肿是脑出血研究的关键内容，脑部软组织血肿会引发脑屏障破坏和水肿。研究表明，在自体注血 1 - 3d 后，C57BL/6 小鼠的同侧基础神经节和皮质的脑部含水量会显著升高。而且，有研究发现，在脑部注血 1d 后，与自体血液相比，供体血液会导致更严重的脑部水肿。因此，可利用供体血液模型进一步开展脑水肿相关研究。